Furaneol CAS 3658-77-3

1. Hypothese der Furanonsynthese in Erdbeeren

Abbildung 1 Hypothese zum Biosyntheseweg von Furanon in Erdbeerfrüchten. 4-Hydroxy-5-methyl-2-methylen-3 (2H) -furanon HMMF; 4-hydroxy-2, 5 - dimethyl-3 (2 h) -furanon HDMF; Erdbeerchinonoxidoreduktase (FaQR); F. Ananassa-Ketonoxidoreduktase FaEO; F. Ananassa O-Methyltransferase FaOMT.

Anschließend wird ein an der HDMF-Biosynthese beteiligtes Enzym teilweise gereinigt. Die beobachtete Verteilung der Enzymaktivität hängt mit der Anwesenheit eines einzelnen Peptids zusammen. Die Sequenzanalyse zeigte, dass das Enzym völlig identisch mit der Proteinsequenz einer reifen induzierbaren Auxin-abhängigen Chinonoxidoreduktase (FaQR) ist. Das FaQR-Protein wird in Escherichia coli funktionell exprimiert und katalysiert die Bildung von HDMF. 4-hydroxy-5-methyl-2-methyl-3 (2H) – Furanon (HMMF) wurde als natürliches Substrat von FaQR und Vorläufer von HDMF identifiziert (Abbildung 1).

FaQR katalysiert die Reduktion von alpha- und beta-ungesättigten Bindungen in hochreaktivem Keten-HMMF, das später in F Ananassa-Ketonoxidoreduktase (FaEO) umbenannt wird. FaEO reduziert nicht die Doppelbindungen von geradkettigen 2-enalen und 2-enalen, sondern hydriert vielmehr einige HMMF-Derivate, die mit funktionellen Methylengruppen substituiert sind. HMMF wurde auch in Tomaten- und Ananasfrüchten nachgewiesen, was darauf hindeutet, dass HDMF in verschiedenen Früchten auf ähnlichen Wegen synthetisiert wird. Klonierung von Solanum lycopersicon EO (SlEO) aus cDNA und Identifizierung des rekombinanten Proteins. Biochemische Studien haben bestätigt, dass SlEO an der Bildung von HDMF in Tomatenfrüchten beteiligt ist. Im Vergleich zu den beiden anderen NAD (P) H-abhängigen Nicht-Flavon-Reduktasen weisen FaEO und SlEO schmalere Substratspektren auf. Um den molekularen Mechanismus der durch FaEO katalysierten Reaktion aufzuklären, wurde bis vor Kurzem ihre Kristallstruktur in sechs verschiedenen Zuständen oder Komplexen bestimmt, darunter Komplexe mit HDMF und drei Substratanaloga. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass das 4R-Hydrid von NAD (P) H auf den ungesättigten C-6-Kohlenstoff des HMMF im Außenring übertragen wird und ein optisch inaktives Enol-Zwischenprodukt bildet, das dann einer Protonierung unter Bildung von HDMF unterliegt.

Es ist erwähnenswert, dass einige Berichte darauf hindeuten, dass die Produktion von Furanon möglicherweise keine direkte Aktivität pflanzlicher Stoffwechselwege ist, sondern vielmehr eine gemeinsame Anstrengung von Erdbeerpflanzen und einem verwandten Bakterium – Methanobacterium. Der vorgeschlagene Weg ist jedoch nicht überzeugend, da es widersprüchliche Berichte über die letzten Schritte von HDMF und DMMF gibt und Tracer-Experimente die vorgeschlagene Umwandlung der Zwischenprodukte Lactose und 6-Desoxy-D-Fructose{{4} nicht unterstützen. }Phosphat zu Furanon.

2. Hefesynthese vonFuraneol

Als Hauptgeschmacksbestandteil fermentierter Sojasauce wurde HEMF erstmals aus fermentierter Sojasauce isoliert. Die Bildung von HEMF wurde durch die Kultivierung der salztoleranten Hefe Zygosaccharomyces rouxii in einem Medium gefördert, das die Reaktionsprodukte von Ribose und Glycinaminocarbonyl (Maillard) enthielt. Der Mechanismus der Verbindung wurde anhand ihrer stabilen Isotope untersucht. Das fünfeckige Gerüst und die Methylseitenkette von HEMF leiten sich von Ribose ab, während die Ethylgruppe von D-Glucose oder Acetaldehyd abgeleitet ist. Die Rolle der Hefe bei der Bildung von HEMF besteht nicht nur darin, D-Glucose-Metaboliten (Acetaldehyd) bereitzustellen, sondern auch Maillard-Reaktionsprodukte mit D-Glucose-Metaboliten zu binden.

Nach Inkubation mit einigen Phosphatkohlenhydraten wurde die Bildung von HMF im Zytoplasmaextrakt von Saccharomyces cerevisiae festgestellt. Da HMF spontan aus Ribulose-5-phosphat über das Maillard-Zwischenprodukt 4,5-Dihydroxy-2,3-pentandion gebildet wird, kann davon ausgegangen werden, dass Ribulose-5-phosphat wird enzymatisch in zytoplasmatischen Extrakten erzeugt und dann durch chemische Reaktionen in HMF umgewandelt. Diese Hypothese wurde durch die Produktion von Hydroxymethylfurfural in einer Mischung bestätigt, die kommerziell erhältliche Enzyme und isotopenmarkiertes D-Glucose-6-phosphat enthielt. Interessanterweise wurde HMF als extrazelluläres Signalmolekül Al-2 identifiziert, das durch das LuxS-Enzym katalysiert wird und eine Rolle bei der bakteriellen interzellulären Kommunikation spielt. Die chemische Bildung von Al-2 aus 5-Phosphat-Ribulose kann auch in vivo auftreten, was möglicherweise der Grund für die Al-2--ähnliche Aktivität in Organismen ohne luxS-Gene ist.

Der Prozess der HDMF-Bildung in Z. rouxii-Hefe unter verschiedenen Kulturbedingungen wurde unter Verwendung von D-1,6-Diphosphat-Fructose als Rohmaterial untersucht. Wenn D-1,6-Diphosphat-Fruktose als einzige Kohlenstoffquelle verwendet wird, sind das Wachstum der Z. rouxii-Hefe und die Bildung von HDMF nicht signifikant. Obwohl Z. rouxii-Hefezellen in einem Medium mit D-Glucose als einziger Kohlenstoffquelle wachsen, wird HDMF nur produziert, wenn D-Fructose-1,6-diphosphat hinzugefügt wird. Der HDMF-Spiegel korreliert konsistent mit der Hefezellzahl und der D-Fructose-1,6--Diphosphat-Konzentration. Nach Zugabe von 1-13CD-Fructose-1,6-Diphosphat wurde nur einfach markiertes HDMF gebildet, während nach Zugabe von 13C6-D-Glucose unmarkiertes Furanon gebildet wurde. Daher stammt der Kohlenstoff von HDMF vollständig aus exogenem D-Fructose-1,6-diphosphat. Ein höherer pH-Wert des Kulturmediums wirkt sich positiv auf die HDMF-Bildung aus, kann jedoch das Zellwachstum verzögern, daher liegt der optimale pH-Wert bei 5,1. Salzstress stimulierte die Produktion von HDMF. Durch Zugabe von o-Phenylendiamin (einem Einfangreagenz für das Dicarbonyl-(Maillard)-Zwischenprodukt) zum Kulturmedium können drei Chinolonderivate erhalten werden, die von D-Fructose-1,6-diphosphat abgeleitet sind. Die Identifizierung dieser Struktur bestätigte zum ersten Mal die chemische Bildung von 1-Desoxy-2,3-Hexadisase-6-phosphat, einem allgemein erwarteten Zwischenprodukt im HDMF-Bildungsweg aber nie entdeckt. Aufgrund der Tatsache, dass HDMF nur in Z verfügbar ist, wurde es in Gegenwart von Rouxii-Zellen nachgewiesen, weshalb angenommen wird, dass mehr Enzymschritte beteiligt sind. Bei Umgebungstemperatur kann HDMF auch chemisch in einer Lösung erzeugt werden, die D-Fructose-1, 6-diphosphat und NAD (P) H enthält. NAD (P) H ist erforderlich und die Anwendung markierter Vorläufer zeigt an, dass das Hydrid des D-Fructose--1,6-diphosphat-Rückgrats auf C-5 oder C-6 übertragen wird. Die biologischen und chemischen Prozesse zur Erzeugung von HDMF aus D-Fructose-1,6-diphosphat scheinen einem ähnlichen Weg zu folgen.

Naturstoffe mit optischer Aktivität weisen während der Biosynthese aufgrund von Stereoselektivität und enzymkatalysierten Reaktionen einen einzigartigen Enantiomerenüberschuss auf. Obwohl erwartet wird, dass HDMF durch die Kombination von Z. rouxii-Hefe und Fruchtenzymen erzeugt wird, ist die natürlich vorkommende Verbindung racemisch. Die schnelle Racemisierung von HDMF erklärt dieses Phänomen aufgrund der Tautomerie von Ketoenolen. Die 1H-NMR- und chirale Kapillarelektrophorese-Analyse des Protonen-Deuterium-Austauschs am Furanonring von C-2 zeigte, dass die Racemisierungsrate von HDMF bei pH 4-5 am niedrigsten war. Um die enzymatische Bildung von HDMF zu verifizieren, führten wir daher Inkubationsexperimente mit Z. rouxii-Hefe und Erdbeerproteinextrakt bei pH 5 durch. Die Bildung von enantiomerenangereichertem HDMF wurde in beiden Experimenten bestätigt, während racemisches Furanon unter neutralen pH-Bedingungen nachgewiesen wurde .

3. Bakterielle Synthese von Furanon

HDMF wurde nach 4 Tagen Wachstum von Pichia capsulata auf L-Rhamnose enthaltendem Casein-Pepton-Medium nachgewiesen. Die Massenspektrometrieanalyse mit stabilen Isotopenverhältnissen bestätigte, dass L-Rhamnose die Kohlenstoffquelle von HDMF ist. Das Zeitverlaufsexperiment führte zu der Hypothese, dass HDMF durch ein Zwischenprodukt gebildet wird, das von Pichia pastoris während des thermischen Sterilisationsprozesses des Kulturmediums produziert wird, wie von der lutherischen Konjugathefe vorgeschlagen. In ähnlicher Weise wurde in den Ergebnissen der Maillard-Reaktion HDMF in dem Medium nachgewiesen, das durch Erhitzen von Zucker und Aminosäuren hergestellt wurde. Im gleichen Fermentationsmedium wurden die HDMF-Gehalte auch durch die Fermentation von Lactococcus lactis subsp. erhöht. Cremoris.

4. Zusammenfassung der Furanonsynthese

3 (2H) – Furanonverbindungen haben eine niedrige Geruchsschwelle und verlockende Aromaeigenschaften, was sie zu wichtigen aromatischen Chemikalien macht. Sie werden bei der Maillard-Reaktion chemisch aus verschiedenen Kohlenhydraten gebildet und kommen daher in vielen verarbeiteten Lebensmitteln vor, wo sie zur Aromabildung beitragen. Furanon kann aber auch von Hefen, Bakterien und Pflanzen produziert werden und seine physiologische Funktion könnte mit der Redoxaktivität zusammenhängen. Obwohl Desoxyzucker wie L-Rhamnose wirksame Vorläufer für HDMF in der Maillard-Reaktion sind, wurde D-1,6-Diphosphat-Fructose als natürlicher Vorläufer in Früchten identifiziert. In Erdbeerfrüchten werden phosphorylierte Kohlenhydrate durch Phosphat- und Wassereliminierung in HMMF umgewandelt, und HMMF wird schließlich durch FaEO (FaQR) zu HDMF reduziert. Die Methylierung von HDMF führt zur Akkumulation von DMMF und wird durch FaOMT katalysiert. Insgesamt wurden durch die Verwendung isotopenmarkierter Vorläufer erhebliche Fortschritte bei der Aufklärung der Biosynthesewege von natürlichem Furanon in Mikroorganismen und Pflanzen erzielt. In naher Zukunft wird das Verständnis der Genomsequenz von Walderdbeeren dabei helfen, Gene mit fehlenden HDMF-Signalwegen zu erkennen, und verbesserte Bildgebungssysteme werden dabei helfen, intrazelluläres Furanon zu lokalisieren. Das Verständnis der relevanten Gene und Enzyme wird eine Grundlage für die Produktion von natürlichem Furanon durch Biotechnologie bilden.