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Proteinase-K-Pulverist eine hocheffiziente, unspezifische Serinprotease, die in der Molekularbiologie und Biochemie weit verbreitet ist, hauptsächlich zum Abbau von Proteinen und zur Entfernung kontaminierender Proteine aus Nukleinsäurepräparaten. Es stammt aus dem Pilz Engyodontium album (früher Tritirachium album) und behält seine Aktivität über einen weiten Temperaturbereich (20–60 Grad) und pH-Wert (4–12) bei, selbst wenn es in einer Lösung mit SDS (0,5–1 %) oder Harnstoff (4 M) unter denaturierenden Bedingungen inkubiert wird.
Das Enzym spaltet effizient eine Vielzahl von Proteinen, einschließlich RNase und DNase, durch Spaltung von Peptidbindungen (wobei es vorzugsweise den Carboxylterminus aliphatischer/aromatischer Aminosäuren hydrolysiert) und wird daher zur Nukleaseentfernung bei der DNA/RNA-Extraktion verwendet, um die Integrität der Nukleinsäuren sicherzustellen. Darüber hinaus wird es häufig bei der Gewebeverdauung (z. B. in Paraffin-eingebetteten Proben), der Zelllyse und bei Proteomikstudien eingesetzt.
Proteinase-K-Pulver wird normalerweise in lyophilisierter Form geliefert, die sehr stabil ist (-20 Grad für Langzeitlagerung) und vor der Verwendung in einem Puffer (z. B. Tris-HCl, EDTA) gelöst werden muss. Seine Aktivität ist von Ca²⁺ abhängig, aber Chelatbildner wie EDTA hemmen die Enzymaktivität nur teilweise. Bei der Handhabung muss eine Selbstzersetzung vermieden werden und eine Hitzeinaktivierung bei 65 Grad wird empfohlen. Aufgrund seiner starken Fähigkeit zur Proteinhydrolyse ist ein sorgfältiger Schutz erforderlich, um Haut- oder Schleimhautkontakt zu vermeiden.
Proteinase-K-Pulver, auch bekannt als Proteinase K oder EC 3.4.21.14, ist eine Serinprotease, die aus Tritirachium album Limber isoliert und gereinigt wird. Seit seiner ersten Isolierung durch Wolfgang Ebeling et al. 1974 fand Proteinase K aufgrund ihrer hohen Aktivität und breiten Substratspezifität breite Anwendung in der Biochemie, Molekularbiologie, Medizin und Industrie.
Anwendungen in der Biochemie und Molekularbiologie
Bei der DNA- und RNA-Extraktion besteht die Hauptfunktion der Proteinase K darin, an Nukleinsäuren gebundene Proteine abzubauen, sodass DNA oder RNA für die anschließende Extraktion und Reinigung in Lösung frei bleiben. Aufgrund seiner Stabilität und hohen Aktivität in Denaturierungsmitteln wie Harnstoff und SDS wird Proteinase K häufig zur Isolierung von Plasmiden oder genomischer DNA und RNA verwendet.
Proteinase K kann die Aktivität von RNAse hemmen und die RNA vor dem Abbau schützen.
1. DNA- und RNA-Extraktion
DNA-Extraktion: Protease K kann Histone hydrolysieren, die an DNA binden, wodurch die DNA in Lösung dissoziieren kann. Anschließend wurden Verunreinigungen durch verschiedene Methoden wie Phenol-Chloroform-Extraktion, Ethanol-Fällung usw. entfernt und gereinigte DNA gesammelt.
RNA-Extraktion: Während des RNA-Extraktionsprozesses sind häufig RNA-Enzyme in der Umgebung vorhanden, und das Probensystem selbst kann auch RNA-Enzyme enthalten, wodurch RNA sehr anfällig für Abbau ist. Eine kleine Menge hinzufügen
2. In-situ-Hybridisierungstechnologie
In der In-situ-Hybridisierungstechnologie wird Proteinase K üblicherweise für die Vorhybridisierungsverarbeitung verwendet, um Proteine rund um die Ziel-DNA zu verdauen, die Chance der Sondenbindung an die Zielnukleinsäure zu erhöhen und das Hybridisierungssignal zu verstärken. Es ist jedoch zu beachten, dass eine zu hohe Proteinase-K-Konzentration, eine zu lange Verdauungszeit oder eine zu hohe Inkubationstemperatur zu Schäden an der Zellstruktur führen kann, die zum Ablösen von Gewebeabschnitten und zum Verschwinden von Zellkernen führen und dadurch die Hybridisierungsergebnisse beeinträchtigen können. Daher ist es in praktischen Anwendungen notwendig, die Konzentration und Behandlungszeit von Proteinase K streng zu kontrollieren.
3. Virusinaktivierung und -desinfektion
Protease K kann aufgrund ihrer starken proteolytischen Aktivität zur Virusinaktivierung und Desinfektion eingesetzt werden. Untersuchungen haben gezeigt, dass die Behandlung von reinem Wasser und häuslichem Abwasser mit einer bestimmten Konzentration an Proteinase K Viren wirksam inaktivieren kann. Protease K kann als vireninaktivierendes Desinfektionsmittel die potenziellen Schäden reduzieren, die herkömmliche oxidative chemische Desinfektionsmittel für den menschlichen Körper verursachen, und seine Herstellung und sein Transport sind sicher und ohne irreversible Umweltverschmutzung.
4. Western Blot und Pulselektrophorese
Protease K wird auch häufig bei der Herstellung von Chromosomen-DNA für gepulste Elektrophorese, Western Blot und andere Experimente verwendet. In Western-Blot-Experimenten kann Proteinase K verwendet werden, um unspezifische Proteine aus der Probe zu entfernen und so die Spezifität und Empfindlichkeit des Blots zu verbessern. In Pulselektrophorese-Experimenten kann Proteinase K Proteinverunreinigungen in DNA-Proben abbauen und die Effizienz der Elektrophorese verbessern.
5. Proteinnachweis und -identifizierung
Proteinase-K-Pulverkann auch zum Nachweis und zur Identifizierung bestimmter Proteine verwendet werden. Bei der Untersuchung der transmissiblen spongiformen Enzephalopathie (TSE) kann Proteinase K beispielsweise zur Verdauung von Proteinen in Gehirngewebeproben und zur Identifizierung des Vorhandenseins von Prionproteinen durch den Nachweis der Resistenz pathogener Prionen gegenüber Proteinase K verwendet werden. Darüber hinaus kann Proteinase K auch für Experimente wie die Bestimmung der Lokalisierung von Enzymen auf Zellmembranen und die Entfernung kationischer Proteine, die an Endotoxine (wie Lysozym und Ribonuklease A) gebunden sind, verwendet werden.
Anwendungen in Medizin und Industrie
Klinische Anwendung: Protease K hat in der Medizin einen gewissen medizinischen Wert. Zum Beispiel die Behandlung von Verdauungsstörungen mit Magenprotease, die Behandlung von Bronchitis mit saurer Protease, die Behandlung von Vaskulitis mit Elastase usw. Darüber hinaus werden Trypsin, Chymotrypsin usw. häufig auch zur Reinigung chirurgischer eitriger Wunden und zur Behandlung von pleuralen serösen Adhäsionen verwendet.
Viruserkennung und -diagnose: Protease K hat auch potenzielle Anwendungen bei der Viruserkennung und -diagnose. Durch die Verdauung der Proteine in der Virusprobe und die Freilegung der Virus-Nukleinsäure wird eine praktische Durchführung nachfolgender Nukleinsäuretests ermöglicht.
2. Industriesektor
Lederindustrie: Protease K wird in der Lederindustrie zur Haarentfernung und Weichmachungsbehandlung eingesetzt, was Zeit sparen und die Arbeitshygienebedingungen verbessern kann.
Textilindustrie: Protease K kann in der Textilindustrie wie der Seidenentschleimung eingesetzt werden.
Lebensmittelindustrie: Protease K kann in der Lebensmittelindustrie zum Zartmachen von Fleisch, zur Alkoholklärung usw. verwendet werden.
Waschmittel: Waschmittel mit Enzymzusatz sind ein neues Produkt unter den Waschmitteln. Waschmittel mit alkalischer Protease können Blutflecken und Eiweißschmutz von der Kleidung entfernen. Achten Sie bei der Anwendung jedoch darauf, die Haut nicht zu berühren, um das Protein auf der Hautoberfläche nicht zu beschädigen und allergische Reaktionen wie Hautausschlag und Ekzeme auszulösen.
Das Molekulargewicht der Proteinase K beträgt etwa 28900 Dalton (28,9 kDa), und es gibt auch Literaturberichte von 29,3 kDa. Seine Aminosäuresequenz und seine dreidimensionale räumliche Struktur sind dem Subtilisin der Serinprotease-Familie sehr ähnlich, es gibt jedoch auch einige einzigartige Merkmale.
Disulfidbindungsstruktur: Protease-K-Moleküle enthalten Disulfidbindungen, die ihre Stabilität erhöhen und es ihnen ermöglichen, ihre Aktivität über einen weiten pH-Bereich und hohe Temperaturbedingungen aufrechtzuerhalten.
Ca²⁺-Bindungsstellen:Proteinase-K-Pulverenthält zwei Ca²⁺-Bindungsstellen, die zwar weit vom aktiven Zentrum entfernt, aber für die Aufrechterhaltung der katalytischen Aktivität des Enzyms von entscheidender Bedeutung sind. Das Entfernen von Ca²⁺ führt dazu, dass die Protease K etwa 80 % ihrer Aktivität verliert, und die Wiedereinführung von Ca²⁺ kann ihre Aktivität nur teilweise wiederherstellen.
Katalytische Triade: Protease K hat eine katalytische Triade Asp-His69-Ser224, die eine Schlüsselstruktur für ihre hydrolytische Aktivität darstellt.
Wirkmechanismus
Protease K kann vorzugsweise Ester- und Peptidbindungen neben dem C--Terminus von hydrophoben Aminosäuren, schwefelhaltigen Aminosäuren und aromatischen Aminosäuren hydrolysieren und so Proteine in kurze Peptide hydrolysieren. Sein Wirkungsmechanismus umfasst hauptsächlich die folgenden Schritte:
Enzymsubstratbindung: Nachdem Protease K mit dem Substrat gemischt wurde, bindet das Substrat an das aktive Zentrum des Enzyms und bildet einen Enzymsubstratkomplex.
Katalytische Reaktion: Unter der Wirkung des aktiven Zentrums wird die Peptidbindung des Substrats hydrolysiert, um ein vom Enzym abgetrenntes Produkt zu bilden.
Die starke Abbauwirkung der Protease K macht sie zu einem Schlüsselreagens bei verschiedenen biochemischen Reaktionen, insbesondere bei DNA- und RNA-Extraktionsprozessen. Protease K kann an Nukleinsäuren gebundene Proteine effektiv abbauen, Nukleinsäuren freisetzen und die Aktivität von Nukleinsäuren hemmen, wodurch der Abbau von Nukleinsäuren während der Extraktion verringert wird.
Speicher- und Verwendungsmethoden
1. Methode speichern
Protease K sollte im Kühlschrank bei -20 Grad gelagert werden, um wiederholtes Einfrieren und Auftauen zu vermeiden. Sollte die Lösung ausfallen, kann sie nicht erneut verwendet werden. Bei der Herstellung von gefriergetrocknetem Proteinase-K-Pulver muss ein Gefriertrocknungsschutzmittel hinzugefügt werden, um einen hohen Feststoffgehalt aufrechtzuerhalten. Allerdings neigt Proteinase K bei Konzentrationen von 20 mg/ml oder höher zur Aggregation und Bildung von Niederschlägen, was eine erhebliche Herausforderung für die Gefriertrocknung mit hohem Feststoffgehalt darstellt.
2. Gebrauchsanweisung
Bei der Verwendung von Proteinase K ist es notwendig, entsprechend den experimentellen Anforderungen eine Lösung mit geeigneter Konzentration herzustellen. Normalerweise beträgt die Arbeitskonzentration von Proteinase K 0,05–0,2 mg/ml. Bei DNA- und RNA-Extraktionsexperimenten erfordert die Extraktion einer Probe etwa 0,1 mg Proteinase K. Um die Effizienz der Nukleinsäureextraktion zu verbessern, kann die Dosierung von Proteinase K entsprechend erhöht werden. Bei der Verwendung von Proteinase K für In-situ-Hybridisierung, Western Blot und andere Experimente ist es notwendig, ihre Konzentration und Verarbeitungszeit streng zu kontrollieren, um eine Schädigung der Zellstruktur zu vermeiden.
Proteinase-K-PulverAls hochaktive und substratspezifische Serinprotease hat sie ein breites Anwendungsspektrum in der Biochemie, Molekularbiologie, Medizin und Industrie. Es kann Proteine, die an Nukleinsäuren binden, abbauen und Nukleinsäuren freisetzen; Erhöhen Sie die Möglichkeit für Sonden, sich in der In-situ-Hybridisierungstechnologie an Zielnukleinsäuren zu binden. Wird zur Vireninaktivierung und -desinfektion verwendet; Entfernen Sie Proteinverunreinigungen in Western-Blot- und Pulselektrophorese-Experimenten; Hat einen medizinischen Wert auf dem Gebiet der Medizin; Wird in Industriebereichen wie der Lederverarbeitung, der Textilindustrie, der Lebensmittelindustrie und der Waschmittelherstellung eingesetzt. Bei der Verwendung von Proteinase K sollte jedoch auf die Lagerungsmethode und die Verwendungsbedingungen geachtet werden, um ihre Stabilität und Aktivität sicherzustellen.
Nebenwirkung
Proteinase K ist eine Breitspektrum-Serinprotease, die aufgrund ihrer einzigartigen enzymatischen Eigenschaften und Stabilität häufig in der Molekularbiologie, Biochemie und medizinischen Forschung eingesetzt wird. Als gefriergetrocknetes Pulver spielt Proteinase-K-Pulver eine entscheidende Rolle bei Experimenten wie der Nukleinsäureextraktion, dem Proteinverdau und der Gewebehomogenisierung. Allerdings birgt die Verwendung biologischer Reagenzien potenzielle Risiken und ihre Nebenwirkungen können die Gesundheit der Bediener und die Sicherheit der Versuchsumgebung gefährden.
Allergische Reaktion
Klinische Manifestationen
Proteinase K kann Überempfindlichkeitsreaktionen vom Typ I mit folgenden Symptomen auslösen:
Hautreaktionen: Hautausschlag, Juckreiz, Urtikaria, Erythem und in schweren Fällen Gefäßödeme können auftreten.
Atemwegsbeschwerden: Husten, pfeifende Atmung, Atembeschwerden, können Asthmaanfälle auslösen.
Systemische Symptome: Schwindel, Engegefühl in der Brust, Brustschmerzen, Muskelschmerzen, Hitzewallungen und in seltenen Fällen ein anaphylaktischer Schock.
Mechanismus des Auftretens
Proteinase K kann als heterologes Protein vom Immunsystem als Antigen erkannt werden und B-Zellen zur Produktion spezifischer IgE-Antikörper anregen. Bei erneutem Kontakt mit einer Person bindet IgE an Rezeptoren auf der Oberfläche von Mastzellen, löst Degranulationsreaktionen aus und setzt Entzündungsmediatoren wie Histamin und Leukotriene frei, die zu allergischen Symptomen führen.
Einflussfaktoren
Individuelle Empfindlichkeit: Eine genetische Veranlagung und eine Vorgeschichte von Allergien (wie Asthma und Ekzemen) erhöhen das Risiko.
Expositionsweg: Das Einatmen von Pulverpartikeln oder direkter Hautkontakt führt eher zu Allergien.
Dosis und Häufigkeit: Eine langfristige oder hochdosierte Anwendung kann die Wahrscheinlichkeit einer Sensibilisierung erhöhen.
Haut- und Schleimhautreizungen
Klinische Manifestationen
Hautreizung: Langfristige Exposition kann zu Rötungen, Trockenheit, Schuppenbildung und sogar Kontaktdermatitis führen.
Augenreizung: Wenn Pulver in die Augen gelangt, kann es zu brennenden Schmerzen, Tränenfluss und einer Verstopfung der Bindehaut führen.
Mechanismus des Auftretens
Die proteolytische Aktivität von Proteinase K kann die Stratum-Corneum-Barriere der Haut stören, während die physikalische Reibung der Puderpartikel die Reizung verstärkt. Die Bindehaut ist aufgrund ihrer dünnen Schleimhaut und der reichlich vorhandenen Blutgefäße anfälliger für chemische Schäden.
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