Thiazolylblau CAS 298-93-1

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Thiazolylblau, besser bekannt als MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid), birgt eine faszinierende Dualität – es ist sowohl ein wichtiges Werkzeug in der Zellbiologie als auch eine chamäleonische chemische Kuriosität. Dieses gelbe kristalline Pulver durchläuft in lebenden Zellen eine überraschende Metamorphose: Mitochondriale Reduktasen spalten seinen Tetrazoliumring und wandeln ihn in einen unlöslichen violetten Formazan-Niederschlag um – eine Reaktion, die optisch so beeindruckend ist, dass sie zum Goldstandard für die Messung der Lebensfähigkeit von Zellen geworden ist. Doch jenseits des Labortischs offenbart MTT noch esoterischere Verhaltensweisen; Seine kristalline Struktur bildet unter dem Mikroskop eigenartige „Fischgräten“-Muster, während seine Redoxeigenschaften es ihm ermöglichen, an exotischen photochemischen Reaktionen teilzunehmen, wenn es bestimmten Lichtwellenlängen ausgesetzt wird. Kurioserweise weist die Verbindung ein seltenes Phänomen namens „Metachromasie“ auf – das Erscheinen unterschiedlicher Farben je nach Konzentration und molekularer Umgebung – eine Eigenschaft, die einst von Textilchemikern genutzt wurde, um „intelligente“ Farbstoffe herzustellen. Jüngste Studien haben seine unerwartete Rolle als schwacher Inhibitor bestimmter Enzyme der Atmungskette aufgedeckt, was darauf hindeutet, dass dieses allgegenwärtige Testreagenz möglicherweise genau die Stoffwechselprozesse, die Wissenschaftler damit untersuchen, subtil beeinflusst hat. Beim Auflösen in organischen Lösungsmitteln zeigen MTT-Lösungen einen ungewöhnlichen Fluoreszenzlöscheffekt, der physikalische Chemiker vor ein Rätsel gestellt hat und darauf hindeutet, dass komplexe intermolekulare Wechselwirkungen noch immer auf eine vollständige Erklärung warten.

Thiazolylblau,Der chemische Name lautet 3-(4,5-Dimethyl-2-thiazol)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid, abgekürzt als MTT, eine wichtige organische Verbindung. Seit Mosman 1983 erstmals über die Verwendung der MTT-Färbung zur Bestimmung von Zellwachstum und -überleben berichtete, wird MTT in großem Umfang in Bereichen wie Biowissenschaften, medizinischer Forschung und Arzneimittelentwicklung eingesetzt. Nachfolgend finden Sie eine detaillierte Erläuterung seines Zwecks:

Anwendung in der zellbiologischen Forschung

 

MTT ist eine der klassischen Methoden zur Bestimmung der Zellproliferation. Während der Zellkultur können Dehydrogenasen wie Succinatdehydrogenase in Mitochondrien lebender Zellen exogenes MTT zu unlöslichem blauvioletten kristallinen Formazan reduzieren, das sich in der Zelle ablagert. Abgestorbenen Zellen fehlt diese reduzierende Fähigkeit und sie produzieren daher kein Formazan. Durch das Auflösen von Formazan in Zellen und die Messung seines Lichtabsorptionswerts bei bestimmten Wellenlängen (z. B. 490 nm oder 562 nm) mithilfe eines ELISA-Lesegeräts (Enzyme -Linked Immunosorbent Assay) kann die Anzahl lebender Zellen indirekt widergespiegelt werden. Innerhalb eines bestimmten Zellzahlbereichs ist die Menge der gebildeten MTT-Kristalle proportional zur Zellzahl, sodass die Zellproliferation anhand des gemessenen Absorptionswerts (OD-Wert) bestimmt werden kann.

Anwendung in der zellbiologischen Forschung

 

MTT kann auch verwendet werden, um die Toxizität von Arzneimitteln oder anderen Behandlungsmethoden (z. B. Strahlenbestrahlung) an kultivierten Zellen in vitro zu bestimmen. Durch den Vergleich der OD-Werte der Behandlungsgruppe und der Kontrollgruppe kann die Wirkung von Medikamenten oder Behandlungsmethoden auf die Zellaktivität bewertet werden. Je größer der OD-Wert, desto stärker ist die Zellaktivität; Im Gegenteil: Je schwächer die Zellaktivität bzw. desto größer die Zelltoxizität. Diese Methode findet breite Anwendung im Arzneimittelscreening, in der toxikologischen Forschung und in anderen Bereichen. Obwohl MTT hauptsächlich zur Messung der Zellproliferation und Zytotoxizität verwendet wird, kann es in einigen Fällen auch zur Unterstützung der Untersuchung der Zellapoptose eingesetzt werden. Während des Prozesses der Zellapoptose verändert sich die Enzymaktivität innerhalb der Zelle, was sich auf die Reduktionsfähigkeit von MTT auswirken kann. Durch den Vergleich der Differenz der OD-Werte zwischen apoptotischen Zellen und normalen Zellen kann das Auftreten einer Zellapoptose vorläufig bestimmt werden. Es ist jedoch zu beachten, dass MTT keine spezielle Methode zum Nachweis von Zellapoptose ist und seine Ergebnisse in Verbindung mit anderen Methoden zum Nachweis von Apoptose umfassend analysiert werden müssen.

Anwendung in der Arzneimittelentwicklung

 

Im Prozess der Arzneimittelentwicklung ist der MTT-Assay eine häufig verwendete Hochdurchsatzmethode für das Arzneimittelscreening. Durch die gleichzeitige Inkubation des Testarzneimittels mit Zellen und die Verwendung des MTT-Assays zur Messung von Veränderungen der Zellaktivität können potenziell aktive Arzneimittelmoleküle schnell gescreent werden. Diese Methode bietet die Vorteile einer einfachen Bedienung, zuverlässiger Ergebnisse und eines hohen Durchsatzes und hat einen wichtigen Anwendungswert in der frühen Phase der Arzneimittelentwicklung. Der MTT-Assay kann auch zur Untersuchung des Wirkmechanismus von Arzneimitteln eingesetzt werden. Durch den Vergleich der Veränderungen der Zellaktivität unter verschiedenen medikamentösen Behandlungsbedingungen kann der Einfluss von Medikamenten auf Prozesse wie Zellproliferation und Apoptose vorab bestimmt werden. Durch die Kombination anderer molekularbiologischer Techniken wie Western Blot und Durchflusszytometrie können die Ziele und Signalwege von Arzneimitteln weiter aufgeklärt werden. Bei der Bewertung der Arzneimittelsicherheit kann der MTT-Assay verwendet werden, um die toxischen Wirkungen von Arzneimitteln auf Zellen zu beurteilen. Durch die Messung der OD-Wertänderungen von Zellen nach einer medikamentösen Behandlung ist es möglich, festzustellen, ob das Medikament zytotoxisch ist und wie stark die Toxizität ist. Dies ist von großer Bedeutung für die Steuerung der präklinischen Forschung und der klinischen Anwendung von Arzneimitteln.

Die Anwendung von MTT in anderen Bereichen

 

In der immunologischen Forschung kann der MTT-Assay zur Bestimmung der Proliferationsfähigkeit von Lymphozyten eingesetzt werden. Durch die gleichzeitige Inkubation von Lymphozyten mit Antigenen oder Immunstimulanzien und die Messung von Veränderungen der Zellaktivität mithilfe des MTT-Assays kann die Immunantwortfähigkeit von Lymphozyten bewertet werden. Diese Methode findet breite Anwendung in der Impfstoffentwicklung, Immuntherapie und anderen Bereichen. In der onkologischen Forschung kann der MTT-Assay zur Bestimmung der Proliferationsaktivität und Arzneimittelsensitivität von Tumorzellen eingesetzt werden. Durch den Vergleich der Veränderungen der OD-Werte von Tumorzellen unter verschiedenen medikamentösen Behandlungsbedingungen können Arzneimittelmoleküle mit hemmender Wirkung auf Tumorzellen gescreent und ihre Antitumorwirkungen bewertet werden. Dies ist von großer Bedeutung für die Steuerung der klinischen Behandlung von Tumoren. In der umwelttoxikologischen Forschung kann der MTT-Assay verwendet werden, um die toxischen Auswirkungen von Umweltschadstoffen auf Zellen zu bewerten. Durch die gleichzeitige Inkubation von Zellen mit unterschiedlichen Schadstoffkonzentrationen und die Messung von Veränderungen der Zellaktivität mithilfe des MTT-Assays können die Toxizität und der Wirkungsmechanismus von Schadstoffen bestimmt werden. Dies ist von großer Bedeutung für die Bewertung der ökologischen Risiken von Umweltschadstoffen und die Formulierung von Umweltschutzrichtlinien. 

Experimentelle Schritte vonThiazolylblauVerfahren:

1: Trypsin verdaut Zellen in der logarithmischen Phase, zentrifugiert und sammelt sie nach Beendigung, um eine Zellsuspension herzustellen, und stellt seine Konzentration durch Zellzahl × 104/ml auf 5–10 ein. Für Anfänger ist es notwendig, die Zellen auf 5–10 × 104/ml zu bringen. Oft weiß man nicht, wo man anfangen soll. Ich bin hier, um Ihnen eine einfache Methode zur Verfügung zu stellen, mit der Sie zunächst die Anzahl der Zellen bestimmen können.

Nehmen wir als Beispiel 25 cm2, die üblicherweise für Zellkulturen verwendet werden:

1) Die Zelldichte beträgt etwa 80 % bis 90 % (die Abbildung unten zeigt den ungefähren Zustand der Zellen bei einer Dichte von 80 % bis 90 %). Entfernen Sie nach der Verdauung und Zentrifugation den Überstand und geben Sie zum Mischen 3 ml Medium hinzu.

2) Nehmen Sie ein neues steriles 15-ml-Zentrifugenröhrchen (für den nächsten Schritt der Inokulation der 96-Well-Platte) und füllen Sie es mit etwa 9 ml Medium

3) Nehmen Sie 1 ml der im ersten Schritt hergestellten 3-ml-Zellsuspension, geben Sie sie in das obere Röhrchen und zählen Sie die Zellen nach dem Mischen. Zu diesem Zeitpunkt beträgt sie im Allgemeinen 5-10 oder weniger × 104/ml, was 5-10 Zellen pro Zelle in 4 Zellen der Zellzähltafel entspricht (siehe Abbildung unten); Reicht die Konzentration nicht aus, wird die Zellsuspension entsprechend dem Zählergebnis hinzugefügt und jeder Tropfen wird als 50 µl berechnet.

4) Die Anzahl der Zellen sollte entsprechend den unterschiedlichen Zwecken des Experiments angepasst werden. Beispielsweise können in einem allgemeinen Zellproliferationsexperiment 2.000 Zellen pro Vertiefung (entspricht einer Zellsuspensionsdichte von 2 × 104/ml) und 5.000 bis 10.000 Zellen pro Vertiefung (entspricht einer Zellsuspensionsdichte von 5 × 104/ml) verwendet werden. Darüber hinaus sollte die Anzahl der Zellen auch anhand ihrer eigenen Eigenschaften, wie beispielsweise der Wachstumsgeschwindigkeit, bestimmt werden. Beispielsweise kann die Dichte schneller wachsender Zellen etwas geringer sein.

2. Nachdem Sie die Zellsuspension vorbereitet haben, mischen Sie sie vorsichtig und geben Sie 100 μl in jedes Loch, sodass die Dichte der zu testenden Zellen 5000–10000/Loch beträgt (das Randloch wird mit sterilem PBS gefüllt).

L Hinweis: Da sich die Zellen nach dem Mischen weiter absetzen, ist es notwendig, während des Inokulationsprozesses wiederholt zu mischen, z. B. einmal alle sechs Löcher, um sicherzustellen, dass die Zelldichte der Inokulation zwischen den Löchern genau gleich ist, was für die Ergebnisse der MTT von entscheidender Bedeutung ist.

3. Stellen Sie die beimpfte Zellkulturplatte zur Kultivierung in den Inkubator, bis die Zellmonoschicht mit dem Boden des Lochs (96-Loch-Flachplatte) bedeckt ist, und geben Sie das Medikament mit Konzentrationsgradient hinzu. Im Prinzip kann das Medikament hinzugefügt werden, nachdem die Zelle an der Wand befestigt ist, oder zwei Stunden oder einen halben Tag, aber wir geben das Medikament oft am Nachmittag des Vortages und am nächsten Morgen hinzu. Im Allgemeinen werden 5–7 Farbverläufe, 100 μl pro Loch und 3–5 Mehrfachlöcher eingestellt. Es wird empfohlen, 6 einzustellen, da es sonst schwierig ist, die reale Situation wiederzugeben. Die folgende Abbildung kann als Referenzschritt für eine 96-Loch-Platte verwendet werden.

L Zur Dosierung geben manche Menschen Medikamente in unterschiedlichen Volumina direkt in 96-Well-Platten, um einen Konzentrationsgradienten zu erzeugen. Aber ich denke, wir sollten versuchen, unterschiedliche Arzneimittelkonzentrationen im EP-Röhrchen zu mischen, dann den Kulturüberstand von der 96-Well-Platte zu entfernen (der mit einer Entnahmepistole abgesaugt werden kann) und 100 µl Kulturmedium mit unterschiedlichen Arzneimittelkonzentrationen hinzuzufügen, um die Genauigkeit der Arzneimittelkonzentration sicherzustellen. Darüber hinaus ist zu beachten, dass bei dieser Methode nicht die gesamte Kulturlösung der 96-Well-Platte abgesaugt werden darf, bevor das Medikament hinzugefügt wird. Sie sollten Proben sofort nach dem Ansaugen eines Teils hinzufügen, um Zelltod durch Austrocknen der 96-Well-Platte zu vermeiden.

Mit 4,5 % CO2 bei 37 Grad 16–48 Stunden lang inkubieren und die Wirkung des Arzneimittels unter dem Umkehrmikroskop beobachten. Die folgende Abbildung zeigt einen typischen Arzneimittelgradienten der Zytotoxizität.

4. Geben Sie 10 μl MTT-Lösung (5 mg/ml, d. h. . 0.5 % MTT) in jede Vertiefung und setzen Sie die Kultivierung 4 Stunden lang fort. Wenn das Medikament mit reagieren kannThiazolylblauDie Kulturlösung kann nach der Zentrifugation verworfen werden und die MTT-haltige Kulturlösung kann nach zwei- bis dreimaligem Waschen mit PBS hinzugefügt werden.

5. Stoppen Sie die Kultur und bereiten Sie die Auflösung und Kristallisation vor.

Thiazolylblau, dessen chinesischer Name Methylblau ist, ist eine wichtige organische Verbindung, die in der Medizin, Biologie und Chemie weit verbreitet ist. In der Medizin wird es häufig zur Behandlung von Nitritvergiftungen, Zyanidvergiftungen usw. eingesetzt und wird auch zur Diagnose und adjuvanten Behandlung einiger Krankheiten eingesetzt. In der biologischen Forschung kann es als Färbemittel zur Markierung von Zellen oder Geweben verwendet werden. Allerdings kann Methylenblau, wie viele Medikamente auch, bei der Anwendung eine Reihe von Nebenwirkungen haben:

Nebenwirkungen des Verdauungssystems

Übelkeit und Erbrechen sind eine der häufigsten Nebenwirkungen von Methylenblau im Verdauungssystem. Wenn Methylenblau in den Körper gelangt, kann es die Magen-Darm-Schleimhaut stimulieren und in schweren Fällen Übelkeit und sogar Erbrechen verursachen. Dieses Symptom ist stärker ausgeprägt, wenn die intravenöse Injektionsgeschwindigkeit zu schnell oder die Dosierung zu hoch ist. Beispielsweise kann es in einigen klinischen Fällen bei Patienten kurz nach der schnellen intravenösen Injektion von Methylenblau zu erheblicher Übelkeit und Erbrechen kommen, was sich auf ihr Wohlbefinden und ihr Behandlungserlebnis auswirkt. Bei einigen Patienten kann es nach der Anwendung von Methylenblau zu Bauchschmerzen kommen, deren Ausmaß je nach individueller Situation variieren kann und von leichten Beschwerden bis hin zu stärkeren Schmerzen reichen kann.

Gleichzeitig kann es auch zu Durchfall kommen, der auf die Beeinträchtigung der Darmperistaltik und der Verdauungsfunktion durch Methylenblau zurückzuführen sein kann und zu abnormalen Darmbewegungen und Veränderungen der Verdauungsflüssigkeitssekretion führt. Langfristiges oder häufiges Auftreten von Bauchschmerzen und Durchfall beeinträchtigt nicht nur die Nährstoffaufnahme und die körperliche Gesundheit des Patienten, sondern kann auch zu anderen Komplikationen führen.

Nebenwirkungen des Harnsystems

Nach der Anwendung von Methylenblau verfärbt sich der Urin blau, was durch die Ausscheidung von Methylenblau und seinen Metaboliten in den Urin über die Nieren verursacht wird. Im Allgemeinen ist diese Veränderung der Urinfarbe vorübergehend und hat keine schwerwiegenden Auswirkungen auf die körperliche Gesundheit. In einigen besonderen Fällen, beispielsweise bei Patienten mit Erkrankungen des Harnsystems, können Veränderungen der Urinfarbe die Diagnose der Krankheit beeinträchtigen, und Ärzte müssen eine umfassende Analyse auf der Grundlage anderer Untersuchungsindikatoren durchführen. Beim Wasserlassen kann es bei manchen Patienten zu einem stechenden Gefühl an der Harnröhrenöffnung kommen.

 

Dies kann auf die stimulierende Wirkung von Methylenblau auf die Harnröhrenschleimhaut zurückzuführen sein, insbesondere wenn die Urinkonzentration hoch ist oder die Harnröhrenschleimhaut beim Wasserlassen gerieben wird, ist das stechende Gefühl stärker ausgeprägt. Dieses Symptom kann bei den Patienten gewisse Beschwerden hervorrufen und ihr tägliches Leben beeinträchtigen.

Neurologische Nebenwirkungen

Schwindel und Kopfschmerzen sind häufige neurologische Nebenwirkungen von Methylenblau. Nach der Anwendung von Methylenblau kann es bei den Patienten zu Schwindelgefühlen und Orientierungslosigkeit im Kopf oder zu Beschwerden wie Schwellungen und Schmerzen im Kopf kommen. Dieses Symptom kann die Aufmerksamkeit und Denkfähigkeit des Patienten beeinträchtigen und die Arbeits- und Lebenseffizienz beeinträchtigen. Das Auftreten von Schwindel und Kopfschmerzen könnte mit den Auswirkungen von Methylenblau auf die Blutgefäße und Nerven des Gehirns zusammenhängen, und der spezifische Mechanismus bedarf noch weiterer Forschung. In seltenen Fällen kann Methylenblau Bewusstseinsstörungen wie Schläfrigkeit, Koma usw. verursachen.

Dies ist in der Regel auf den übermäßigen Gebrauch von Methylenblau oder auf eine Überempfindlichkeit des Patienten gegenüber dem Arzneimittel zurückzuführen, was zu einer starken Hemmung des Zentralnervensystems führt. Bewusstseinsstörungen sind eine schwerwiegende Nebenwirkung, die die Lebenssicherheit des Patienten gefährden kann und eine sofortige Notfallbehandlung erfordert.

1. Wozu dient Thiazolylblautetrazoliumbromid?

Thiazolylblau-Tetrazoliumblau (MTT) kann zur Messung der Zellproliferation verwendet werden. MTT erzeugt eine gelbliche Lösung, die durch mitochondriale Dehydrogenasen lebender Zellen in dunkelblaues, wasserunlösliches MTT-Formazan umgewandelt wird.

2.Ist Thiazolylblau sicher zu lagern?

Temperaturbedingungen: Verschließen Sie das Pulver und lagern Sie es zur Gefrierkonservierung im Kühlschrank bei -20 Grad, was die Haltbarkeit effektiv verlängern kann (normalerweise 1–2 Jahre); Zur kurzfristigen Lagerung (innerhalb eines Monats) kann es vorübergehend bei 4 Grad Kühlbedingungen aufbewahrt werden.

Licht-beständig und feuchtigkeitsbeständig- Anforderungen: MTT-Pulver ist licht-empfindlich und sollte in braunen Reagenzflaschen oder transparenten, mit Alufolie umwickelten Flaschen gelagert werden. Gleichzeitig sollten Trocknungsmittel (z. B. Kieselgel) hinzugefügt werden, um zu verhindern, dass das Pulver Feuchtigkeit aufnimmt und zusammenbackt.

3.Wird sich die Farbe von Thiazolylblau ändern?

Wenn in der Lösung ein blau-violetter Niederschlag ausfällt oder die Farbe dunkler wird, ist dies ein Zeichen dafür, dass sie oxidiert wurde und nicht weiter verwendet werden kann.
Stellen Sie die Lösung nicht bei Raumtemperatur oder in einer hellen Umgebung auf, da sie sonst schnell versagen kann.

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