GLP-1(Verknüpfung:https://www.bloomtechz.com/synthetic-chemical/peptide/glp-1-peptide-cas-87805-34-3.html) ist ein Polypeptidhormon, das aus 30 Aminosäuren besteht. Mit der eingehenden Forschung zu GLP-1 wurden immer mehr Synthesemethoden entwickelt. In diesem Artikel werden die derzeit bekannten Synthesemethoden von GLP-1 systematisch vorgestellt.
Methode 1, Festphasensynthese:
Die Festphasensynthese ist eine weit verbreitete Methode zur Peptid- und Proteinsynthese und wird auch häufig für die Synthese von GLP-1 verwendet. Bei der Festphasensynthese wird die Kernstruktur durch die Verknüpfung der ersten Aminosäure mit dem Harz gebildet. Anschließend wird der Reihe nach die nächste Aminosäure hinzugefügt und mit einem geeigneten Kondensationsmittel chemisch umgesetzt. Schließlich kann das Zielprodukt durch Abspaltung des Polypeptids vom Harz gewonnen werden.
Die Bedeutung der Festphasensynthese besteht darin, dass sie die Automatisierung und Produktion der Peptidsynthese in großem Maßstab ermöglicht. Zu den derzeit gängigen Festphasensynthesemethoden gehören Fmoc und Boc. Unter diesen nutzt die Fmoc-Methode die N-Fmoc-Schutzgruppe zum Schutz des Peptids, während die Boc-Methode tert-Butyloxycarbonyl zum Schutz der Carboxylgruppe verwendet.
Methode zwei, Flüssigphasensynthese:
Die Flüssigphasensynthese ist eine traditionelle Methode der Peptidsynthese, bei der die Reaktanten für die Reaktion in die flüssige Phase gebracht werden. Der Vorteil der Flüssigphasensynthese besteht darin, dass die Reaktionsbedingungen mild sind und sich für die Modifikation empfindlicher chemischer Strukturen eignen. Aufgrund zu vieler Reaktanten ist der Reinigungsprozess jedoch relativ umständlich. Zu den chemischen Reaktionen in der Flüssigphasensynthese gehören:
1. Kondensationsreaktion:
Die Kondensationsreaktion ist eine der grundlegendsten Reaktionen in der Peptidsynthese, das heißt, die durch Kondensationsmittel wie DCC und HOBt initiierte Carboxylgruppe wird durch eine Acylierungsreaktion mit der Aminogruppe der Aminosäure verbunden. Die Reaktionsbedingungen sind mild und die Ausbeute hoch.
2. Eliminierungsreaktionen:
Die Eliminierungsreaktion besteht darin, das Methionin durch NaBH4 und andere Reduktionsmittel zum Dithiol zu reduzieren und es so inaktiv zu machen. Die Reaktion muss unter basischen Bedingungen durchgeführt werden.
3. Entfernung von Schutzgruppen:
Aufgrund der unterschiedlichen Funktionen der Aminosäuren in der Peptidkette werden zum Schutz unterschiedliche Schutzgruppen verwendet. Nach Abschluss der Synthese muss die Schutzgruppe entfernt werden. Bei der Fmoc-Methode wird üblicherweise Piperidin zur Entfernung von Fmoc verwendet; während bei der Boc-Methode TFA zum Entfernen von Boc verwendet wird.
Methode drei, chemische Synthese:
GLP-1 ist ein Polypeptidhormon mit wichtigen biologischen Aktivitäten. Seine Synthese kann durch verschiedene Methoden erfolgen, wobei die chemische Synthese eine der am häufigsten verwendeten Methoden ist. Der Vorteil der chemischen Synthese besteht darin, dass hochreine Zielprodukte hergestellt werden können, die für die Produktion in großem Maßstab geeignet sind. Im Folgenden werden die chemische Synthesemethode und die detaillierten Schritte von GLP-1 vorgestellt.
1. Syntheseweg und Schutzgruppenauswahl:
Das GLP-1-Molekül besteht aus 36 Aminosäuren, darunter 21 L-Typ- und 15 D-Typ-Aminosäuren. Vor der Durchführung der Synthese ist es notwendig, einen geeigneten Syntheseweg auszuwählen und entsprechend den Synthesebedingungen die entsprechende Schutzgruppe auszuwählen. Die Fmoc-Festphasensynthese wird üblicherweise für automatisierte Synthesen im großen Maßstab verwendet. Diese Methode nutzt den N-9-Fluorimido-Carboxylschutz (N-Fmoc) als Schutzgruppe und muss außerdem eine geeignete sekundäre Schutzgruppe (z. B. tert-Butyl oder Methyl) auswählen, um den Schutz bestimmter Stellen sicherzustellen. Jedes Mal, wenn eine neue Aminosäure hinzugefügt wird, muss zuerst die Fmoc-Schutzgruppe entfernt werden, und dann wird die geschützte Kopplungssubstanz der nächsten Aminosäure hinzugefügt.
2. Synthese der Kernaminosäuresequenz:
Die Kernsequenz von GLP-1 besteht aus 21 Aminosäuren, darunter eine Schlüsselsequenz Serin und vier Prolyl-Glutaminsäure-Dipeptidsequenzen. Bei der Festphasensynthese lässt sich die Synthese der Kernsequenz in folgende Schritte unterteilen:
2.1. Fügen Sie Essigsäurecarbamat (Fmoc-NH-CH2CO2Et) und 2-Cl-Trt-Cl zum Festphasen-Kunstharz hinzu und führen Sie eine Kondensationsreaktion mit DIC/NMM-Kopplungsmittel durch.
2.2. Entfernen Sie die Fmoc-Schutzgruppe durch Entschützungsreaktion.
2.3. Fügen Sie die nächste Aminosäure hinzu und wiederholen Sie Schritt 1 und Schritt 2 nacheinander, bis die Kernsequenz synthetisiert ist.
2.4. Bildung von Pentapeptidstrukturen auf Festphasenharz. Geben Sie das Acetalisierungsreagenz zum Festphasenharz hinzu, reagieren Sie mit dem N-terminalen Erkennungsmittel (z. B. HBTU), fügen Sie die Seitenkettenschutzgruppe von Serin als Hilfsreduktionsmittel hinzu und entfernen Sie dann die Fmoc-Schutzgruppe.
2.5. Unter der Katalyse der Bacillus subtilis-Transferase (ProTide) unterliegt die Pentapeptidstruktur einer Austauschreaktion mit der Vorstufe von Serin-Iodacetat.
3. Synthese der restlichen Aminosäuresequenz:
Nach Abschluss der Synthese der Kernsequenz ist es notwendig, die restlichen Aminosäuren, einschließlich L- und D-Typ-Aminosäuren, weiter hinzuzufügen. Die Zugabe dieser Aminosäuren muss von der Kernsequenz ausgehen, die nächste Aminosäure in der Reihenfolge hinzufügen und das entsprechende Kondensationsmittel verwenden, um chemische Reaktionen durchzuführen, bis ein vollständiges GLP-1-Polypeptidmolekül synthetisiert ist. Während dieses Prozesses ist es auch notwendig, je nach Bedarf eine geeignete Schutzgruppe auszuwählen und die Schritte Reaktion, Entfernung der Schutzgruppe und Zugabe der Aminosäure nacheinander durchzuführen.
4. Behandlung mit Natriumhydroxid:
Nachdem alle Aminosäuren hinzugefügt wurden, bildet sich auf dem Festphasenharz eine unvollständig synthetisierte Peptidkette, die zu einem vollständig ausgebildeten Peptidmolekül verarbeitet werden muss. Zunächst sollte das nicht gebildete Peptid durch Natriumhydroxid hydrolysiert werden, sodass die ursprünglich am Harz befestigte C-terminale Carboxylgruppe vom Harz und die Schutzgruppe in Wasser abgespalten wird. Nach der Hydrolysereaktion wird das Zielprodukt erhalten.
5. Fällung und Wäsche:
Nach der Behandlung wird die hydrolysierte Lösung mit Säure behandelt, um das Zielprodukt auszufällen. Anschließend wurde das Pellet in Wasser resuspendiert und anschließend intensiv gewaschen, um Verunreinigungen zu entfernen.
6. Reinigung:
Der letzte Schritt ist die Reinigung des gewünschten Produkts, üblicherweise mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie. Während dieses Prozesses kann die Reinheit des Produkts durch den Nachweis des Peaks der Lösung im Massenspektrum bestimmt werden. Kurz gesagt, die chemische Synthese von GLP-1 erfordert mehrere Runden komplexer Reaktionen und strenge Reinigungsverfahren, um schließlich das aktive Zielprodukt zu erhalten.
Methode vier, Biosynthese:
GLP-1 ist ein wichtiges Polypeptidhormon mit verschiedenen physiologischen Wirkungen, darunter die Förderung der Insulinsekretion, die Unterdrückung des Appetits, die Reduzierung des Körpergewichts und die Aufrechterhaltung der Insulinsensitivität usw. Die Biosynthesemethode von GLP-1 wird hauptsächlich von L-Zellen synthetisiert in der Bauchspeicheldrüse, und seine Syntheserate wird durch die Nahrungsaufnahme reguliert. Die detaillierten Schritte werden wie folgt vorgestellt:
1. Vorbereitende Arbeiten vor der Synthese:
Vor der Biosynthese von GLP-1 müssen einige vorbereitende Arbeiten durchgeführt werden, darunter die Bestimmung des verwendeten Zelltyps, die Festlegung der Kulturbedingungen und die Auswahl des geeigneten katalytischen Enzyms. L-Zellen sind die Hauptquelle der GLP-1-Synthese, da sie Vorläufer der beiden Hormone GIP (Glucagon-ähnliches Peptid 1) und GLP-1 enthalten. L-Zellen können aus dem Darmepithel von Kaninchen oder Mäusen isoliert werden. Vor der Biosynthese müssen Zellen in ausreichender Zahl kultiviert werden und es müssen ausreichend Nährstoffe und geeignete Kulturbedingungen bereitgestellt werden. Darüber hinaus ist es notwendig, das geeignete katalytische Enzym auszuwählen, um die Reaktion zu fördern.
2. Synthese und Verarbeitung von Vorläufern:
Die Biosynthese von GLP-1 findet hauptsächlich in L-Zellen statt und sein Vorläufer besteht aus zwei Hormonen, GIP und GLP-1. Nach dem Eintritt in endokrine Zellen werden GIP und GLP-1 von proteolytischen Enzymen verarbeitet und in einzelne Peptide gespalten. An diesem Prozess sind eine Reihe von Enzymen und Cofaktoren beteiligt, darunter Vorläufer-Polypeptidazidase (PC2), Isomerase und späte Adhäsionsfaktoren.
3. Gegenseitige Umwandlung zwischen Polypeptidsegmenten:
Nach der Verarbeitung werden die GIP- und GLP{0}}-Peptide rekombiniert, um das GLP-1-Polypeptid zu bilden. Dieser Prozess erfordert die Verwendung des Glucagon-ähnlichen Peptids 1 (GLP-1) als Matrize, mit der andere einzelne Peptide kombiniert werden, um neue zusammengesetzte Polypeptide zu bilden. Dieser Prozess erfordert auch einige spezifische Enzyme und Faktoren, darunter Prohormone Konvertase 1/3 (PC1/3) und Carboxypeptidase E (CPE).
4. GLP-1-Sekretion:
Nachdem GLP-1 synthetisiert und verarbeitet wurde, wird es im Zytoplasma und in den inneren Vesikeln endokriner Zellen gespeichert. Bei Stimulierung durch die Ernährung setzen endokrine Zellen GLP-1 frei und gelangen über Mikrogefäße in den Blutkreislauf. Dieser Prozess wird durch eine Reihe von Signaltransduktionswegen, einschließlich cAMP-Ca, reguliert und kontrolliert2 plususw.
Kurz gesagt, die Biosynthese von GLP-1 beinhaltet die gemeinsame Wirkung mehrerer Verbindungen und Faktoren. Die Kombination von Biosynthese und chemischer Synthese kann eine bessere Grundlage und Unterstützung für die Forschung und Produktion von GLP bieten-1.
Methode fünf, enzymatische Synthese:
Unter enzymatischer Synthese versteht man die Synthese von Peptidketten durch die Katalyse biologischer Enzyme. Im Vergleich zu herkömmlichen Flüssigphasensynthesemethoden kann die enzymatische Synthese bei Raumtemperatur durchgeführt werden und es kann aus einer breiten Palette von Rohstoffen ausgewählt werden. Zur Katalyse der Synthese werden üblicherweise Enzyme wie Theta-Liquid-Synthase, AEP, ACE usw. verwendet.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die oben genannten Methoden praktikable Methoden für die GLP-1-Synthese sind. Für unterschiedliche Versuchsbedingungen und pharmazeutische Produktionsumgebungen eignen sich unterschiedliche Methoden.